代謝研究NMT標準化方案
代謝研究NMT標準化方案
一、視頻資源
二、參考文獻
Leaf Extract from Lithocarpus polystachyus Rehd. Promote Glycogen Synthesis in T2DM Mice
Abnormal mitochondrial function impairs calcium influx in diabetic mouse pancreatic beta cells
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Oscillatory glucose flux in INS 1 pancreatic β cells: A selfreferencing microbiosensor study
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Oxygen consumption oscillates in single clonal pancreatic beta -cells (HIT)
三、常測哪些指標
Ca2+、H+、O2、葡萄糖
四、檢測這些離子流、分子流，有什么生物學意義
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2）科研案例
使用患有糖尿病的KK-Ay小鼠和正常的C57BL/6J小鼠的胰腺β細胞研究了線粒體的功能和形態，Ca2+通道，并且使用非損傷微測技術（NMT）測定了葡萄糖誘導的Ca2+內流。實驗發現，葡萄糖誘導正常胰腺β細胞的Ca2+內流增加，但是KK-Ay的Ca2+并沒有發生明顯變化，當加入genipin后，能夠恢復KK-Ay小鼠胰腺β細胞的Ca2+內流。因此，在患有糖尿病小鼠的胰島β細胞中，缺失線粒體功能是改變Ca2+內流導致的胰島素分泌異常的重要因素。胰島組織（Islet）是非常適合用于非損傷微測技術測定的材料，具有穩定而明顯的Ca2+、H+和K+的流速，這為研究糖尿病的機理提供了重要的活體手段。
Li F, Porterfield DM, Zheng XY, Wang WJ, Xu Y, Zhang ZM. Abnormal mitochondrial function impairs calcium influx in diabetic mouse pancreatic beta cells. Chin Med J (Engl). 2012;125(3):502-510.
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1）O2生理功能概述
2）科研案例
通過測定L6肌肉細胞生理狀態的UCP3超表達對葡萄糖和脂肪酸氧化，對線粒體解偶聯和ROS產生的影響，以及用非損傷微測技術測定了細胞的耗氧。實驗發現肌肉細胞溫育在血糖正常或者血糖過高的環境中導致棕櫚酸氧化增加，但是，腺病毒綠色熒光蛋白感染或者慢性低劑量的解偶聯劑二硝基苯酚對棕櫚酸氧化沒有影響。增加UCP3不影響葡萄糖的氧化，但是二硝基苯酚和胰島素處理引起了葡萄糖氧化的增加。二硝基苯酚引起耗氧的增加和線粒體膜電勢的下降，但是增強UCP3表達沒有引起線粒體膜電勢改變。最后，線粒體ROS隨著UCP3表達的增加顯著下降。通過非損傷微測技術研究UCP3引起的耗氧變化，為糖尿病藥物開發和篩選提供了活體檢測的手段。
MacLellan JD, Gerrits MF, Gowing A, Smith PJ, Wheeler MB, Harper ME. Physiological increases in uncoupling protein 3 augment fatty acid oxidation and decrease reactive oxygen species production without uncoupling respiration in muscle cells. Diabetes. 2005;54(8):2343-2350.
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2）科研案例
取活體小鼠肝臟組織，添加外源葡萄糖后，利用NMT可以觀測到肝臟組織對葡萄糖的吸收逐漸增加，在加入外源巴馬甜茶提取物后，肝臟組織吸收葡萄糖的速率瞬間上升2-3倍，且在較高的吸收速率水平上維持一段時間。首次通過在體實驗展示了巴馬甜茶提取物急性降血糖的潛力。
Wang J, Huang Y, Li K, et al. Leaf Extract from Lithocarpus polystachyus Rehd. Promote Glycogen Synthesis in T2DM Mice. PLoS One. 2016;11(11):e0166557.
五、如何應用NMT開展糖尿病活體組織水平研究
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近年來，世界各國糖尿病的患病率均有極具增加的趨勢，據WHO統計，1994年糖尿病患者人數為1.20億，1997年為1.35億，2000年為1.75億，2010年為2.39億，2017年為4.25億。目前，世界糖尿病患者人數最多的前3位國家為印度、中國、美國，據國際糖尿病聯盟最新數據，2017年全球的4.25億糖尿病患者中，中國是患病人數達到1.14億，并呈現發病率升高、患者年輕化的趨勢。糖尿病給患者帶來的并發癥有160余種，其中80%的糖尿病患者死于心腦血管疾病，而治療糖尿病及其并發癥的費用占據國家整個醫療支出的7%-13%。
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- 指標的契合度：葡萄糖指標，提供了研究中最直接的指標測量。
- 檢測材料廣：在細胞水平，組織水平都能進行檢測，給與研究者不同材料水平的檢測方式，達到同一研究方向、不同材料水平都能進行測量。
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1）ZHANG Zong-ming,et al. Abnormal mitochondrial function impairs calcium influx in diabetic mouse pancreatic beta cells. Chinese Medical Journal. 2012,125(3):502-510.點擊查看全文
2）J. Darcy MacLellan, et al. Physiological Increases in Uncoupling Protein 3 Augment Fatty Acid Oxidation and Decrease Reactive Oxygen Species Production Without Uncoupling Respiration in Muscle Cells. Diabetes. 2005,54:2343-2350.點擊查看全文
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3）D. Marshall Porterfield , et al.Oxygen consumption oscillates in single clonal pancreatic beta -cells (HIT). Diabetes.2000,49:1511-1516.點擊查看全文
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4）D. Marshall Porterfield, et al. Oscillatory glucose flux in INS 1 pancreatic β cells: A selfreferencing microbiosensor study. Analytical Biochemistry. 2011,411(2): 185–193.點擊查看全文
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5）Yingbai Shen, et al. Leaf Extract from Lithocarpus polystachyus Rehd. Promote Glycogen Synthesis in T2DM Mice. PLoS One. DOI:10.1371/journal.pone.0166557 2016.點擊查看全文
六、如何應用NMT開展活體組織代謝研究
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- 組織器官水平研究
隨著研究的深入，單細胞的生理狀態，以及對不同環境的生理反應，與處于機體組織器官中的細胞的差異，已逐漸成為研究中的瓶頸。NMT不僅可以檢測單細胞，還可以實現對細胞的原位檢測，以及對活體組織器官的在體檢測，很好地彌補了這一研究手段的空白。
- 活體研究
可在離體或在體的情況下，對活體組織，開展代謝研究，無需提取、無需染色。
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1）Wang J, et al. Leaf Extract from Lithocarpus polystachyus Rehd. Promote Glycogen Synthesis in T2DM Mice. Plos One. 2016, 11(11):e0166557.點擊查看全文
2）D. Marshall Porterfield , et al. Oxygen consumption oscillates in single clonal pancreatic beta -cells (HIT). Diabetes.2000,49:1511-1516.點擊查看全文
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3）Land SC, et al. O2 availability modulates transmembrane?Ca2+ flux via second-messenger pathways in anoxia-tolerant hepatocytes. Journal of Applied Physiology.2009, 82:776-783, 1997.點擊查看全文
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4）D. Marshall Porterfield, et al. Oscillatory glucose flux in INS 1 pancreatic β cells: A selfreferencing microbiosensor study. Analytical Biochemistry. 2011,411(2): 185–193.點擊查看全文
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5）J. Darcy MacLellan, et al. Physiological Increases in Uncoupling Protein 3 Augment Fatty Acid Oxidation and Decrease Reactive Oxygen Species Production Without Uncoupling Respiration in Muscle Cells. Diabetes. 2005,54:2343-2350.點擊查看全文
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6）ZHANG Zong-ming,et al. Abnormal mitochondrial function impairs calcium influx in diabetic mouse pancreatic beta cells. Chinese Medical Journal. 2012,125(3):502-510.點擊查看全文
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七、可以檢測哪些樣品
1、動物樣品
1）細胞
神經細胞、腫瘤細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等
2）組織器官
腫瘤、皮膚、胃粘膜、胰島、腦（海馬體等）、胚胎（大鼠、魚）、斑馬魚皮膚/鰓、耳蝸、心臟（香螺）、卵（魚、雞蛋、爪蟾）、骨骼、角膜、脊椎（豚鼠）、肌肉組織（肌纖維、心肌）
3）其它動物樣品
珊瑚、螨蟲、昆蟲（果蠅幼蟲的腸、蟑螂血腦屏障、按蚊、長紅錐蝽）、蝌蚪、水蛭、藍蟹（微感毛）、變形蟲、水絲蚓
2、植物樣品
1）營養器官
莖：邊材、心材、微管形成層、木質部
2）生殖器官
花：花瓣、花瓣表皮細胞、花粉
種子：整體、胚
果實：果殼、果皮、果肉（蘋果、柑橘）、籽粒、棉花纖維、棉桃
3）細胞：植物懸浮細胞、液泡
4）愈傷組織
3、微生物樣品
酵母細胞、菌絲、菌落、微藻、細菌（大腸桿菌）
4、其它生物樣品
周叢生物
5、非生物樣品
金屬、混凝土、泥沙、納米材料、生物醫藥材料
八、樣品需要做哪些前處理
國際領先的非損傷微測技術最大的特點就是活體、無損檢測，因此動植物材料在檢測前，不需要任何的液氮速凍、染色、研磨處理等。
1、動物單細胞
因NMT是活體檢測，故從培養箱中拿出來后，置于培養皿中，直接檢測即可。
2、動物組織
因NMT是活體檢測，無需提前處理。如檢測部位天然暴露在外，如斑馬魚皮膚離子細胞、側線毛細胞，直接檢測即可。如檢測部位位于體內，需在檢測時暴露出檢測部位（可采用麻醉的方式），后檢測即可。
3、植物根莖葉等組織器官
天然暴露在外的組織器官，例如根、莖、葉的表面，無需任何處理，直接檢測即可。水培、土培、砂培、平板培養均可。
4、植物原生質體/液泡
因NMT是基于微傳感器/探針的非損傷檢測，檢測時不接觸樣品，故原生質體、液泡需要從組織或者細胞中，提取出來后檢測。
5、植物葉片的表皮細胞、葉肉細胞、鹽腺細胞、保衛細胞
無需提前處理。因這些細胞處于組織內部，故檢測時采用撕取等方式，暴露出相應細胞即可。
6、植物花粉管
離體萌發：在培養皿中萌發一段時間后即可直接檢測；在體萌發：將柱頭置于培養皿中，待萌發一段時間后即可直接檢測。
7、植物果實
無需提前處理。如待測部位位于果實內部，需在檢測前暴露出相應部位即可。
8、植物懸浮細胞
無需提前處理。檢測時，置于培養皿中檢測即可。
九、有哪些檢測方式？
即瞬時處理，是指在檢測過程中，在正常測試液中瞬間加入所需的干旱脅迫溶液（PEG或甘露醇等溶液）的處理方法，目的是為了觀察瞬間干旱脅迫下，樣品短時間內的離子/分子的變化趨勢，即短時效應。
2、預處理/提前處理好后檢測
是指在干旱脅迫一段較長的時間后（數十分鐘/數小時/數天），觀察植物離子/分子進出的情況，即長時效應。
十、檢測環境是空氣還是溶液
檢測時，只要求待測部位浸于溶液中（無需整體都浸在溶液里）。
十一、樣品是如何檢測的
十二、可以送樣檢測嗎
可以送樣檢測。目前非損傷微測技術測試服務由中關村NMT產業聯盟統籌管理，由遍布全國的25家NMT創新平臺服務中心，提供檢測服務。點擊獲取測試服務
